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摘要：目的利用斑马鱼模型和中医药整合药理学平台（TCMIP），探究天麻抗癫痫的主要活性成分及潜在的作用机制。方法采用健康发育至72h的AB系斑马鱼幼鱼为实验动物，以氨茶碱诱导形成癫痫模型，观察天麻对斑马鱼癫痫样行为的改善作用；利用TCMIP筛选天麻抗癫痫的靶点，构建天麻与癫痫的蛋白质相互作用（protein-proteininteraction，PPI）网络，绘制药材-成分-靶点-通路-疾病网络；利用Autodockvina软件对活性成分和靶点进行分子对接。结果天麻对氨茶碱诱导的斑马鱼的癫痫样行为发生频率具有显著改善作用（P＜0.05）。通过TCMIPv2.0整合分析发现，天麻抗癫痫的核心靶点有25个，天麻素、天麻醚苷、谷甾醇、棕榈酸、西托糖苷可能是天麻抗癫痫的主要活性成分；这些活性成分可以直接作用于相应关键靶点，参与调节神经递质的平衡、维持神经元细胞正常电生理活动并影响酮体生成。结论天麻对癫痫样症状具有明显的改善作用，其抗癫痫的潜在机制可能与调节神经递质的平衡、神经元细胞的电生理稳态和酮体的生成有关，为天麻的临床应用提供理论依据。

癫痫是一种由多种原因引起的复杂的神经系统疾病，常伴随运动、感觉、植物神经、意识等障碍，严重危害人类的健康。随着我国人口老龄化，老年人群中癫痫发病率呈上升趋势。难治性神经系统疾病的创新药物研发进展缓慢，现有的抗癫痫药物不良反应较大，因此，寻找新型、高效、低毒的抗癫痫药物仍然是临床迫切需要解决的问题[1]。

天麻为兰科植物天麻GastrodiaelataBl.的干燥块茎，主产于湖北、四川、陕西等地[2]。《本草纲目》中记载天麻“眼黑头旋，风虚内作，非天麻不能治。天麻乃定风草，故为治风之神药”。研究发现，天麻对神经细胞损伤具有显著的保护作用，具有抗惊厥、防止癫痫大发作、镇静催眠、镇痛等作用[3-4]。中医临床治疗癫痫的处方中，其核心药味均有天麻[5]。但天麻抗癫痫的具体物质基础和作用机制仍有待深入挖掘。

目前用于癫痫疾病研究的模型主要为大鼠和小鼠模型，在大规模药物筛选方面具有局限性且成本较高。斑马鱼作为一种新兴的模式动物，基因组与人类同源性达到87%。研究发现，斑马鱼中可观察到啮齿动物类似的癫痫表型，且斑马鱼产卵量高、实验周期短、成本低，可以实现高通量筛选[6-8]。中医药整合药理学研究平台（TCMIP）作为一个专业的网络药理学工具，整合了中医药百科全书（ETCM）等优质的数据库资源，通过人工智能、网络可视化等先进的方法形成了其独特的优势，可以为研究天麻抗癫痫的潜在作用机制提供强大的数据支撑和计算辅助[9]。本研究采用模式动物斑马鱼观察天麻对癫痫发作的保护作用，并利用TCMIP平台分析其潜在机制。1材料

1.1动物

AB型斑马鱼，由山东省科学院药物筛选技术重点实验室提供，饲养于斑马鱼养殖系统，温度设定为28℃，pH6.8～7.5，14h光照/10h黑暗，用丰年虫早晚饲喂2次。实验所用幼鱼均由健康雌雄鱼以2∶1比例自然交配而得。

1.2药品与试剂

天麻（批号）购自安徽六安，由山东第一医科大学（山东省医学科学院）药学与制药科学学院韩利文副研究员鉴定为兰科植物天麻G.elataBl.的干燥块茎；氨茶碱（质量分数为98%）、丙戊酸钠（质量分数为98%）购自阿拉丁试剂公司；天麻素（批号B，质量分数≥98%）购自源叶生物；乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯。

1.3仪器

斑马鱼养殖系统（北京爱生公司）；LC-30A液相色谱系统、Shim-packGISTC18色谱柱（mm×3.0mm，2μm）（日本岛津公司）；SZX-16型体视荧光显微镜（日本Olympus公司）；SPX-B-G型博讯光照培养箱（上海基星生物科技有限公司）。

2方法

2.1天麻提取物的制备及含量测定

天麻用粉碎机粉碎，过60目筛，称取10g天麻粉末，置于mL圆底烧瓶中，加入mL80%乙醇，加热回流提取2次，每次1h，合并提取液，减压浓缩，真空干燥，得到天麻提取物，于4℃保存，临用前用蒸馏水稀释至所需浓度。按照《中国药典》年版方法进行测定，以乙腈-0.05%磷酸水溶液梯度洗脱，检测波长nm，以天麻素为对照品，外标一点法计算，天麻提取物中天麻素的质量分数为1.24%。

2.2药液的配制

精密称定氨茶碱，溶于蒸馏水，配制成质量浓度为10mg/mL的溶液；精密称定丙戊酸钠，溶于蒸馏水，配制成质量浓度为mg/mL的溶液。于4℃保存备用，临用前用蒸馏水稀释至所需浓度。

2.3斑马鱼实验

将正常孵化的受精后72h（hourspost-fertilization，hpf）斑马鱼幼鱼转移至6孔板中，设置模型组、丙戊酸钠（0.25mg/mL）组和天麻提取物（0.1、1.0、10.0mg/mL）组，每组10条。各给药组加入相应药物预处理24h后，各组再加入氨茶碱（2mg/mL）造模4h，观察斑马鱼幼鱼活动情况，记录斑马鱼抽搐频率（1min内发生抽搐的次数）。

2.4天麻活性成分和癫痫相关靶点的获取

以“天麻”为关键词，在TCMIPv2.0药材数据库功能模块中检索获得天麻的活性成分及靶点；以“癫痫”“癫痫痉挛”“癫痫性发作”“癫痫持续状态”为关键词在疾病相关分子库模块进行检索，获取癫痫相关的靶点。

2.5天麻与癫痫靶点蛋白质相互作用（protein-proteininteraction，PPI）网络的构建及核心靶点的筛选

通过TCMIPv2.0的中医药关联网络挖掘功能模块构建天麻与癫痫靶点的PPI网络。计算网络拓扑值，以度值、节点紧密度、节点介度的2倍中位数卡值，获得核心节点。将筛选到的天麻与癫痫的共同靶点作为核心靶点。度值越高，相应核心节点的重要性越高。

2.6核心靶点基因本体（geneontology，GO）功能和京都基因与基因组百科全书（Kyotoencyclopediaofgenesandgenomes，KEGG）通路富集分析

将“2.5”项下得到的核心靶点分别导入DAVID（



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